那么如何能控制ELISPOT檢測的質量呢？如果有一種細胞和一種刺激物，并且ELISPOT斑點頻率是已知的話，那么就有了一個ELISPOT的標準系統(tǒng)。每次其它樣品檢測時，只要帶上這個系統(tǒng)，實驗者就可以用標準系統(tǒng)來質控待測樣品的ELISPOT檢測。這也是所有其它檢測質控的基本原理。

      現(xiàn)在的關鍵是找到這樣一種細胞和一種刺激物，每次都能做出完全相同的ELISPOT結果。

二、標準細胞必須采用凍存細胞庫

     首要問題是細胞。我們知道，細胞是有生命的，不像無生命的物質那樣容易保存。那么能不能采用新鮮細胞呢，比如每次都從同一個志愿者身上采集？不能。因為志愿者的健康狀態(tài)和免疫狀態(tài)都是動態(tài)的，雖說采自同一個人，但是細胞免疫水平可能會有變化，ELISPOT結果無法完全重復。那么能不能采集細胞之后長期飼養(yǎng)呢？不能。且不說長期培養(yǎng)成本高且周期長，細胞本身的免疫水平和克隆數(shù)目都會隨著培養(yǎng)和傳代而發(fā)生變化。

      能滿足ELISPOT檢測長期不變化的只能是凍存細胞庫。一次采集大量細胞凍存在-197°C的液氮環(huán)境中，細胞的斑點頻率可以在數(shù)年之內恒定不變。PBMC分離和凍存復蘇的方法參見本網(wǎng)站內容。

三、標準刺激物選用CEF或者ICE

     那么，刺激物選擇什么呢？非特異性的刺激物很便宜，但是不能用于質控。三個原因阻礙了這一點。

    其一、非特異性的刺激物刺激效果不穩(wěn)定。如圖9.2所示，非特異性的刺激物（有絲分裂原Mitogen）的刺激曲線幾乎沒有平坦的部分。也就是說，刺激物的濃度有細微變化，馬上就會體現(xiàn)在刺激斑點數(shù)目的變化上了，這樣實驗結果很難完全重現(xiàn)。相反，抗原的刺激曲線非常平坦，只要達到有效刺激濃度，斑點頻率就不再變化。

     其二，非特異性刺激物的刺激原理與特異性的刺激物刺激原理不同。一般來說，質控系統(tǒng)和被質控的體系之間越相近越好：經(jīng)過相同的處理，接受相同的影響因素，發(fā)生相同的物理、化學、生物過程。但是非特異性刺激物刺激是單細胞過程，與抗原經(jīng)APC呈遞而刺激T細胞是完全不同的過程。所以用非特異性刺激反應質控與特異性刺激反應質控，從原理上也說不同。

     其三，非特異性刺激物多數(shù)是蛋白質，比如PHA與ConA，效價不穩(wěn)定，容易失活，不易保存。相對而言，作為抗原的蛋白和多肽，免疫原性和刺激效果要穩(wěn)定得多。

      綜上所述，在質控系統(tǒng)中，標準刺激物宜選用抗原。抗原中，以T細胞表位肽組成簡單，機理清楚，結果穩(wěn)定，所以是首選。再則考慮到標準刺激物對健康人的T細胞也應該能刺激作用，所以國際上選定三種常見病毒CMV、EBV、Flu Viurs，把它們的32條T細胞表位肽集中起來，作為ELISPOT標準樣性刺激物CEF。另有簡化版的23條肽肽庫ICE（貨號CT370），更加實用。 

 四、實驗室內部質控與實驗室之間的質控以及國家質控體系

      以上介紹了ELISPOT質控系統(tǒng)的原理與組成?，F(xiàn)在來介紹一下質控系統(tǒng)的應用范圍。根據(jù)質控系統(tǒng)的應用范圍，可以分為以下三個層次。

     基本的層次是實驗室內部質控系統(tǒng)。比如一個實驗室有好幾組實驗人員，會在很長的時間內（一年或數(shù)年）做高質量的ELISPOT檢測。這就需要用到實驗室內部的質控系統(tǒng)。因為實驗室內部的條件相對穩(wěn)定，管理相對統(tǒng)一，實驗室內部質控系統(tǒng)的技術目前已經(jīng)非常成熟。達科為公司有整套建立實驗室內部ELISPOT質控系統(tǒng)的方案，已經(jīng)幫國內數(shù)家實驗室建立了這一系統(tǒng)。實踐也證明了該系統(tǒng)有效可行，指控效果非常明顯。

     第二個層次是實驗室之間的質控系統(tǒng)。當今的科研有合縱連橫的趨勢，一些重大的科研項目或者疫苗的臨床評估往往是跨實驗室、跨地域甚至跨國家的聯(lián)合項目。為了使這些分布在不同地區(qū)不同時間的ELISPOT檢測有相同的標準和可信度，必須采用實驗室之間的質控系統(tǒng)。就我們達科為公司與國內十余家實驗室聯(lián)合作的評估而言，實驗室之間的質控存在唯一的一個非技術障礙，那就是凍存質控細胞的運輸問題。

     凍存細胞更好能通過液氮運輸，如果采用小型背負式液氮罐，實驗者可以在同一城市的不同實驗室之間運輸凍存細胞，但是對于跨城市或者跨國家的長途運輸就不太可能了。液氮罐上飛機或者火車都是非法的。如果采用干冰運輸，凍存細胞的狀態(tài)和存活率就會打折扣。我們的研究表明，經(jīng)過干冰運輸?shù)募毎婊盥手挥?0%左右。并且干冰運輸?shù)目煽啃砸膊荒芡耆玫奖ＷC，一旦干冰耗盡或者細胞未完全被干冰包裹，細胞的存活率就會直線下降，甚至完全死亡。

     第三個層次是國家質控系統(tǒng)。任何成熟的檢測技術都會有相應過國家標準和質控系統(tǒng)。但是由于ELISPOT技術還在發(fā)展中，目前世界上還沒有任何一個國家建立了ELISPOT技術的國家標準和質控系統(tǒng)。美國是該項工作開展得比較早的國家，目前仍然在不同實驗室之間作驗證工作，研究建立質控系統(tǒng)的可行性。

    如表9.1所示，這是我們一次實驗的結果?？梢钥吹剑叭齻€實驗室的結果重復性很好，但是第四個實驗室的結果明顯偏小。